0.   引言

【研究意义】茶叶籽是茶树［Camellia sinensis (L.) O. Kuntze］有性繁殖后结出的籽实，属茶栽培过程的副产品，常作为农业废弃物，以堆肥的方式进行利用。茶叶籽富含油脂，不饱和脂肪酸和多种抗氧化成分含量高，2009年中国卫生部第18号公告将茶叶籽油列为新资源食品名单。茶叶籽油属高端食用油，市场售价约250元/升，经济价值较高。茶叶籽粕是油脂生产废弃物，其蛋白质含量较高（15%～20%）^[1]，随着茶叶籽油行业的发展，如何利用好茶叶籽粕成了新课题。【前人研究进展】食源性生物活性肽资源的开发利用是当下生物医药的新兴领域^{[2, 3]}。研究表明，茶叶源蛋白经不同蛋白酶酶解后，具有不同程度的抗氧化作用^[4-6]。例如，通过酶解法制备的茶籽多肽具有抗氧化活性^{[7, 8]}；Wang等^[9]研究表明，不同蛋白酶对牡丹籽蛋白进行水解，其水解产物均具有抗氧化活性，其中以碱性蛋白酶水解的活性最强。因此，可以通过酶解食源蛋白质，从中发现具备抗氧化^{[4, 9]}、抑菌^[10]、降糖^[11]和降血压^[12]能力的生物活性肽，课题组前期也从白茶和乌龙茶中发现了具备降血糖^[13]、抗氧化^[14]、抗炎^[15]能力的生物活性肽。【本研究切入点】茶为福建省地理标志产品，而茶叶籽作为茶生产中的副产物，成熟深加工产品相对较为有限，将茶叶籽粕蛋白通过酶解法制备生物活性肽，技术上可行。【拟解决的关键问题】本研究拟采用碱性蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶对茶叶籽粕蛋白粗提物进行酶解，并比较不同酶解物的抗氧化和抑制α-葡萄糖苷酶活性。茶叶籽粕蛋白的提取、及不同酶解物抗氧化活性和抑制α-葡萄糖苷酶活性的比较是本研究的关键。

1.   材料与方法

1.1   材料、试剂与仪器

茶叶籽粕（2022年脱壳茶叶籽榨油后得），由福建一颗茶农业科技股份有限公司提供。

碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶（酶活分别为6×10⁵ 、1×10⁵ 、6×10⁵ U·g⁻¹，食品级，安琪酵母股份有限公司）；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2,2'-联氨-双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺盐（ABTS）、三氯乙酸（TCA，分析纯，上海麦克林生物技术公司）；铁氰化钾［K₃Fe(CN)₆］、三氯化铁（FeCl₃）、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；还原性谷胱甘肽［梯希爱（上海）化成工业发展有限公司］；α-葡萄糖苷酶（≥10 U·mg⁻¹，美国Sigma公司）；对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（上海源叶生物科技有限公司）。

分析天平［SE602F，奥豪斯仪器（上海）有限公司］；漩涡混匀仪（HY-2）、pH计（PHS-3S，上海仪电科学仪器有限公司）；石墨消解仪（SH420F，山东海能科学仪器有限公司）；自动凯氏定氮仪（K9840，山东海能科学仪器有限公司）；电热恒温培养箱（ZXDOP-B2050，上海智城分析仪器制造有限公司）；多功能微孔板酶标仪［Infinite M200 Rro，帝肯（上海）贸易有限公司］；恒温水浴锅［HH-6S，拓赫机电科技（上海）有限公司］；冷冻干燥机（LGL-20F，北京松源华兴科技发展有限公司）。

1.2   前处理

参考李慧珍等^[6]和Shen等^[16]的方法并改进，称取茶叶籽粕（过80目筛）100 g，按料液比1∶5（g∶mL，以下同），100℃水浸提15 min，无纺布茶包袋过滤（以下同），重复3次，以去除水溶性物质；取滤渣，再加70%乙醇，超声10 min去除茶皂素，过滤，重复3次；用石油醚（60～90℃）浸提4 h，重复3次；再以预冷丙酮4℃清洗3次，以脱除脂溶性物质，置于通风橱挥干有机溶剂，备用。

1.3   茶叶籽粕蛋白粗提物制备

参考Shen^[16]的方法，称取经前处理的茶叶籽粕10 g，按料液比1∶40加入400 mL 0.1 mol·L⁻¹ NaOH溶液，在磁力搅拌器中搅拌（40℃、5 h），以4000 r·min⁻¹离心10 min，收集上清液。取一定体积的茶叶籽粕蛋白提取液，加入1 mol·L⁻¹的HCl，调节溶液的pH至2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5，4℃静置2 h，4000 r·min⁻¹离心10 min取沉淀，水洗沉淀至中性，冷冻干燥，得茶叶籽粕蛋白质粗提物。

1.4   茶叶籽粕蛋白粗提物得率、纯度与残留茶多酚含量测定

茶叶籽粕蛋白粗提物得率^[17]按下式计算：

式中，Y为茶叶籽粕蛋白粗提物得率，%；M₁为茶叶籽粕蛋白粗提物干重，g；M₀为经处理的茶叶籽粕干重，g。

按照GB 5009.5—2016《食品中蛋白质的测定》第一法，利用凯氏定氮法测定茶叶籽粕蛋白粗提物纯度。GB/T 8313—2018《茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法》定量测定茶叶籽粕蛋白粗提物中的残留茶多酚含量。

1.5   茶叶籽粕蛋白酶解

在酶解过程中，蛋白酶按其特异的酶切位点作用于蛋白，可将其切割成不同的肽段，因此本研究选用碱性蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶3种蛋白酶对茶叶籽粕蛋白粗提物进行酶解。参考王南南等^[18]方法并改进。酶解温度及pH如下：碱性蛋白酶（55℃，pH 10.0）；中性蛋白酶（50℃，pH 7.0）；木瓜蛋白酶（40℃，pH 6.0），底物浓度为2%蛋白溶液（w∶w），加酶量6000 U·g⁻¹，酶解时间为3 h，期间每30 min调一次pH。酶解后，100℃灭酶10 min，冷却后离心（8000 r·min⁻¹，10 min），经0.22 μm滤膜除杂，收集滤液进行冷冻干燥，即得3种蛋白酶酶解物。

1.6   抗氧化能力评价

1.6.1   DPPH自由基清除率

参考Yang^[19]的方法并稍作修改。向96孔板加入不同质量浓度的酶解物水溶液（12.5、25、50、100、200、400 μg·mL⁻¹）与DPPH（0.2 mmol·L⁻¹，95% 乙醇溶液溶解）各100 μL ，样品对照组由100 μL C₂H₅OH和100 μL酶解物水溶液，空白对照组为100 μL H₂O和100 μL DPPH（0.2 mmol·L⁻¹）95% C₂H₅OH，混匀并在室温下避光反应30 min，测定517 nm处吸光度值A。以还原型谷胱甘肽（Glutathione，GSH）为阳性对照组，并按下式计算DPPH自由基清除率。

式中，A₁：样品组；A₂：样品对照组；A₀：空白对照组。

1.6.2   ABTS自由基清除率

参考王小平等^[20]方法。将7.4 mmol·L⁻¹ ABTS溶液与2.6 mmol·L⁻¹ K₂S₂O₈进行等量混合，室温下避光保存16 h，配制成ABTS⁺储备液。用无水乙醇稀释，使溶液在734 nm处吸光度为0.7±0.02，制成ABTS⁺工作液。向96孔板加入不同质量浓度酶解物水溶液（12.5、25、50、100、200、400 μg·mL⁻¹）50 μL与ABTS⁺工作液200 μL ，室温下暗处避光反应6 min，在734 nm处测定样品的吸光度值A。乙醇替代ABTS^·+工作液作为样品对照组，水代替样品作为空白对照组。以GSH为阳性对照组，并按下式计算ABTS⁺自由基的清除率。

式中，A₁：样品组；A₂：样品对照组；A₀：空白对照组。

1.6.3   总还原力

参考Wang等^[21]方法。向5 mL离心管中依次加入不同质量浓度酶解物水溶液0.5 mL（浓度分别为350、400、450、500、550、600 μg·mL⁻¹），pH 6.6、0.2 mol·L⁻¹磷酸盐缓冲液0.5 mL，1% K₃Fe(CN)₆ 0.5 mL，于50℃水浴下反应20 min，取出冷却后，再加入0.5 mL 10% TCA，混匀后4000 r·min⁻¹离心10 min。取上清液100 μL于96孔板，依次加入100 μL H₂O和20 μL 0.1% FeCl₃，混匀。在室温下反应10 min，700 nm处测定吸光度值A。以水代替样品溶液作为空白。以GSH为阳性对照组，并按下式计算总还原能力。

式中，A₁：样品组；A₂：空白组。

1.7   α-葡萄糖苷酶抑制作用

参考Lv等^[22]方法。样品、阿卡波糖、α-葡萄糖苷酶、pNPG溶液均用0.2 mol·L⁻¹磷酸盐缓冲液（pH 6.9）配制。取不同浓度（0.25、0.5、1、2、4、8 mg·mL⁻¹）样品溶液分别与0.5 U·mL⁻¹的α-葡萄糖苷酶溶液各100 μL ，混匀后37℃孵育10 min，再将底物对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（pNPG，5 mmol·L⁻¹）100 μL加入反应体系中，37℃下再孵育20 min，加1 mL碳酸钠溶液（0.1 mol·L⁻¹）停止反应，在405 nm处用酶标仪测定吸光度值A。以阿卡波糖（Acarbose）为阳性对照，并按下列公式计算α-葡萄糖苷酶的抑制率。

式中，A₁为样品组，即样品+ α-葡萄糖苷酶+pNPG；A₂为样品对照组，即样品+PBS（磷酸盐缓冲液）+pNPG；A₃为空白对照组，即PBS+α-葡萄糖苷酶+pNPG；A₄为空白组，即PBS+PBS+pNPG。

1.8   数据处理及统计分析

IC₅₀值（清除50% DPPH自由基和ABTS自由基以及抑制50% α-葡萄糖苷酶所需的浓度）由清除（抑制）率百分比与酶解物浓度确定，以酶解物浓度为横坐标，清除（抑制）率为纵坐标做线性回归。试验数据以“平均值±标准差”表示（n=3），采用SPSS 25.0软件进行单因素方差分析，使用LSD法和Games-Howell法进行显著性分析，以P＜0.05为差异有统计学意义，以Origin 2021进行绘图和线性相关分析。

2.   结果与分析

2.1   蛋白粗提物得率与纯度

蛋白质为两性物质，当净电荷为零时，其溶解度最低。不同pH（2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5）条件下沉淀茶叶籽粕蛋白粗提物，其得率及其纯度见图1。随着pH值的升高，茶叶籽粕蛋白粗提物的得率和纯度呈现先升后降的变化。pH=3.5时蛋白粗提物纯度最高，且显著高于pH 2.0～3.0和pH 4.0～4.5；pH 2.0～3.5时各组的蛋白得率无显著性变化，但pH 4.0～4.5时蛋白得率显著低于pH=3.5。综合考虑茶叶籽粕蛋白粗提物得率及纯度，最终确定以pH=3.5进行沉淀，所得粗提物得率为7.7%、纯度27.6%。同时经检测，茶叶籽粕蛋白粗提物中残留茶多酚含量为0.01%，可排除茶多酚对其抗氧化活性及抑制α-葡萄糖苷酶作用的干扰。

图  1  茶叶籽粕蛋白粗提物的得率及纯度

注：不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。

Figure  1.  Yield and protein content of tea seed meal extraction process

Note: Different lowercase letters indicate significant difference (P<0.05).

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2.2   抗氧化能力评价

以GSH为阳性对照药，通过DPPH自由基清除率、ABTS自由基清除率、总还原力，评价酶解物的抗氧化能力强弱。

2.2.1   DPPH自由基清除力

图2为不同酶解物对DPPH自由基清除率的测定结果，可知，当浓度为12.5～400 μg·mL⁻¹时，3种酶解物对DPPH自由基清除力随着酶解物浓度的增加而上升，呈明显的量效关系。当浓度为400 μg·mL⁻¹时，碱性蛋白酶酶解物、中性蛋白酶酶解物、木瓜蛋白酶酶解物对DPPH自由基清除率分别为90.47%、72.17%、86.92%。上述结果表明，3种酶解物对DPPH自由基有较好的清除能力，3种酶解物作为电子供体与自由基反应，中止DPPH自由基链反应。

图  2  不同浓度下谷胱甘肽和3种蛋白酶酶解物的DPPH自由基清除率

Figure  2.  DPPH free radical scavenging activities of glutathione and 3 hydrolysates at varied concentrations

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3种酶解物在浓度为12.5～200 μg·mL⁻¹时与DPPH自由基清除率存在良好的线性关系，回归方程和相关系数如下：碱性蛋白酶酶解物，Y=0.3624X+20.9450，r=0.9825；中性蛋白酶酶解物，Y=0.2724X+19.9680，r=0.9843；木瓜蛋白酶解，Y=0.3257X+16.6080，r=0.9846。即，3种蛋白酶解物对DPPH自由基清除率的IC₅₀大小排序依次为中性蛋白酶酶解物110.25 μg·mL⁻¹、木瓜蛋白酶酶解物102.52 μg·mL⁻¹和碱性蛋白酶酶解物80.17 μg·mL⁻¹。比较而言，碱性蛋白酶酶解物对DPPH自由基清除能力最强。

2.2.2   ABTS自由基清除率

图3为不同酶解物对ABTS自由基清除率的测定结果，可知，当浓度为2.5～80 μg·mL⁻¹时，GSH对ABTS自由基清除率呈明显的量效关系。当浓度为12.5～400 μg·mL⁻¹时，3种酶解物对ABTS自由基清除力随着样品浓度的提高而增强，亦呈明显的量效关系。当浓度为80 μg·mL⁻¹，阳性对照GSH对ABTS自由基清除力最强，为91.43%；当浓度为400 μg·mL⁻¹时，3种酶解物对ABTS自由基清除力最强，均达到95%以上。

图  3  不同浓度下谷胱甘肽和3种蛋白酶酶解物的ABTS自由基清除率

Figure  3.  ABTS free radical scavenging activities of glutathione and 3 hydrolysates at varied concentrations

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3种酶解物在浓度为12.5～200 μg·mL⁻¹时与ABTS自由基清除率存在良好的线性关系，回归方程和相关系数如下：碱性蛋白酶酶解物，Y=0.3208X+10.2880，r=0.9995；中性蛋白酶酶解物，Y=0.2898X+12.8160，r=0.9993；木瓜蛋白酶酶解物，Y=0.2740X+11.1430，r=0.9933。经计算，3种蛋白酶解物对ABTS自由基清除率的IC₅₀大小排序依次为木瓜蛋白酶酶解物141.83 μg·mL⁻¹、中性蛋白酶酶解物128.31 μg·mL⁻¹和碱性蛋白酶酶解物123.79 μg·mL⁻¹。

2.2.3   总还原力

图4为不同酶解物对总还原力的测定结果，可知，GSH和3种酶解物随浓度的增加总还原力随之增加围内，呈明显的量效关系。当浓度为700 μg·mL⁻¹时，3种酶解物及阳性对照GSH的总还原力达到最强，具体而言：碱性蛋白酶酶解物为0.458，中性蛋白酶酶解物0.427，木瓜蛋白酶酶解物0.398，GSH 1.038。横向比较，碱性蛋白酶酶解物最强，其次中性蛋白酶酶解物，木瓜蛋白酶酶解物最低。还原力的强弱主要取决于其提供电子的能力，上述结果表明，茶叶籽粕蛋白经碱性蛋白酶酶解后，相较于中性蛋白酶酶解物和木瓜蛋白酶酶解物，提供了更多具备还原性的物质。

图  4  不同浓度下谷胱甘肽和3种蛋白酶酶解物的总还原力

Figure  4.  Total reducing power of glutathione and 3 hydrolysates at varied concentrations

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2.3   α-葡萄糖苷酶抑制率

图5为不同酶解物对α-葡萄糖苷酶抑制率测定结果。以阿卡波糖为阳性对照品，比较3种酶解物对α-葡萄糖苷酶抑制率，可知，当浓度为500～8000 μg·mL⁻¹时，阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶抑制率呈明显的量效关系。当浓度为62.5～1000 μg·mL⁻¹时，3种酶解物对α-葡萄糖苷酶抑制率随着样品浓度的提高而增强，呈明显的量效关系。当浓度1000 μg·mL⁻¹时，3种酶解物对α-葡萄糖苷酶抑制率最强，分别为：碱性蛋白酶酶解物93.13%、中性蛋白酶酶解物72.87%、木瓜蛋白酶酶解物80.46%。

图  5  不同浓度下阿卡波糖和3种蛋白酶酶解物对α-葡萄糖苷酶抑制率

Figure  5.  α-glucosidase inhibition of acarbose and 3 hydrolysates at varied concentrations

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3种酶解物在浓度为31.25～500 μg·mL⁻¹时与α-葡萄糖苷酶抑制率存在良好的线性关系，回归方程和相关系数如下：碱性蛋白酶酶解物，Y=0.1482X+12.2450，r=0.9911；中性蛋白酶酶解物，Y=0.1022X+0.4428，r=0.9925；木瓜蛋白酶酶解物，Y=0.1226X+2.4771，r=0.9924。经计算，3种蛋白酶解物对α-葡萄糖苷酶抑制率的IC₅₀大小排序依次为中性蛋白酶酶解物484.90 μg·mL⁻¹、木瓜蛋白酶酶解物387.63 μg·mL⁻¹和碱性蛋白酶酶解物254.76 μg·mL⁻¹。

3.   讨论与结论

茶蛋白中非水溶谷蛋白含量达80%以上，谷蛋白中含有大量的疏水官能团和二硫键，碱溶液对谷蛋白的氢键具有破坏作用，可提高谷蛋白的提取率^[23]。碱提酸沉法通过加入碱溶液使植物细胞中的蛋白溶出，再通过加酸调整pH值后，使蛋白质类物质因达到等电点而沉淀，此方法具有操作简单、提取快速等优点。何玮等^[17]通过碱提酸沉，确定油茶籽蛋白的等电点pH=3.5，得率为6.6%，与本研究结果相近。

氧化应激是自由基在体内产生的一种负面作用，是导致人体衰老和各种疾病的原因之一^[24]。目前体外抗氧化活性评价方法主要有清除自由基、还原金属离子和抑制脂质过氧化^[25]。由于茶叶籽粕蛋白粗提物为非水溶性蛋白，水溶性较差，本研究仅将茶叶籽粕蛋白酶解后的产物进行活性测定比较，关于酶解前后的活性变化有待进一步考察。Wang等^[9]发现，牡丹籽粕经不同蛋白酶酶解后具有抗氧化活性，其中碱性蛋白酶酶解物对自由基清除率最高（DPPH IC₅₀=0.18 mg·mL⁻¹，ABTS IC₅₀=1.57 mg·mL⁻¹，还原力0.594）。本研究结果也显示，经不同蛋白酶酶解后的茶叶籽粕蛋白对DPPH自由基清除、ABTS自由基清除和总还原力上也存在差异，这说明采用不同蛋白酶对同一蛋白质的不同位点进行酶切，所获得的蛋白酶解物生物活性有差异。

糖尿病是一种慢性代谢疾病，其特征是餐后血糖水平升高，可引起多种慢性并发症，成为全球公共卫生的重大威胁^[26]。α-葡萄糖苷酶是小肠碳水化合物消化的重要因子，并且是调节餐后高血糖的关键治疗靶点，抑制糖酶活性是治疗糖尿病的有效策略。α-葡萄糖苷酶抑制剂通过竞争性抑制减少碳水化合物的消化，使葡萄糖吸收延缓并降低高血糖，而不需要胰岛素分泌^[27]。冯俊^[28]通过碱性蛋白酶水解油茶籽蛋白制备具有α-葡萄糖苷酶抑制作用的多肽。Gu等^[29]通过木瓜蛋白酶水解小米蛋白分离出具有降血糖活性的小米蛋白多肽。本研究结果表明，3种茶叶籽粕蛋白酶解物均能抑制α-葡萄糖苷酶活性，其中碱性蛋白酶酶解物抑制α-葡萄糖苷酶效果最强。

综上所述，茶叶籽粕蛋白的等电点pH=3.5，此蛋白质粗提物得率为7.73%，纯度27.63%，残留茶多酚含量为0.01%。茶叶籽粕蛋白酶解物均有抗氧化活性和α-葡萄糖苷酶抑制作用，其中采用碱性蛋白酶酶解的效果较强，具备开发成为抗氧化和抑制α-葡萄糖苷酶生物活性肽的潜力。